O sistema dois-hidrido de levedura para confirmação da sinalização de APP Tipo-Noth

Inúmeras potenciais funções foram sugeridas para a APP (Proteína Precursora de Amilóide de Alzheimer), contudo, fisiologicamente, a função precisa da APP não foi ainda desvendada. A APP tem características consistentes com a função de molécula-receptora, capaz de reconhecer sinais extracelulares. Também relevante para este trabalho, é o facto de que a sinalização através de RIP (Proteólise Intramembranar Regulada) tem consequências na expressão génica, como no caso da sinalização tipo-Notch. Tal como a proteína Notch, a APP é processada resultando num fragmento C-terminal designado por AICD (Domínio Intracelular da APP). Neste trabalho é focado o papel importante na sinalização nuclear desempenhado pelo fragmento AICD, especificamente através da interacção com proteínas adaptadoras, promovendo a transcrição. Com o objectivo de contribuir para uma melhor compreensão da base molecular da DA (Doença de Alzheimer), torna-se importante investigar as vias de localização nuclear do AICD e o seu envolvimento na transcrição génica, possivelmente afectando proteínas até agora não associadas à DA. Por estes motivos é fundamental a identificação de novas proteínas que interajam com a APP. Um rastreio foi efectuado, utilizando o sistema Dois-Híbrido em Levedura, para identificar interacções específicas do AICD no cérebro humano e, assim, caracterizar o interactoma do AICD. Foi feito o rastreio de aproximadamente 1.1x108 clones de uma biblioteca de cDNA de cérebro humano com o domínio C-terminal da APP com a mutação Y687E, que mimetiza o estado fosforilado. De experiências anteriores deste laboratório sabemos que a tirosina-687 afecta a localização subcelular da APP e é também consensual que a fosforilação é importante nos mecanismos de transdução de sinais, daí a utilização deste mutante parecer apropriada. O rastreio originou 55 clones positivos que foram analisados para identificar proteínas que interagem com a APP. Dois clones são particularmente importantes, a RanBPM e a Transportin-SR2, visto que estão associadas ao transporte de proteínas para o núcleo e confirmam a sinalização nuclear da APP. ABSTRACT: Many putative functions for APP (Alzheimer’s amyloid precursor protein) have been suggested, although the precise physiological function of APP remains to be elucidated. APP has characteristics consistent with it having a role as a receptor, capable of mediating extracellular signals. Also of relevance to the work described here is that RIP (Regulated Intramembrane Proteolysis) signalling can have consequences in gene expression, similar to Notch signalling. Like the latter, APP is processed by RIP resulting in a C-terminal fragment known as AICD. Here we test the hypothesis that the AICD fragment may play an important role in nuclear signalling, specifically by interacting with adaptor proteins potentiating transcription. Therefore, in order to contribute to our understanding of the molecular basis of AD (Alzheimer’s disease) it is important to investigate the pathways of AICD nuclear targeting and its involvement in gene transcription, possibly affecting other proteins hitherto not associated with AD. Thus, it is important to identify AICD binding proteins. A Yeast Two-Hybrid (YTH) screen was performed to identify human brainspecific AICD binding proteins, and thus characterize the AICD interactome. The screen of approximately 1.1 x108 clones from a human brain cDNA library was carried out using the AICD fragment with an Y687E mutation, which mimics phosphorylation on that residue. From previous work carried out in the laboratory we know that tyrosine-687 phosphorylation affects subcellular localization of APP, and it is also recognized that phosphorylation events are important in signal transduction mechanisms, hence the use of this mutant is appropriate. The YTH screen yielded 55 positive clones that were analysed and several novel brain-specific APP binding proteins were identified. Two clones were particularly important, RanBPM and Transportin-SR2, being that they are associated with the nuclear transport of proteins, and support the nuclear signalling for APP.

Analysis of multirate behavior in electronic systems

Esta tese insere-se na área da simulação de circuitos de RF e microondas, e visa o estudo de ferramentas computacionais inovadoras que consigam simular, de forma eficiente, circuitos não lineares e muito heterogéneos, contendo uma estrutura combinada de blocos analógicos de RF e de banda base e blocos digitais, a operar em múltiplas escalas de tempo. Os métodos numéricos propostos nesta tese baseiam-se em estratégias multi-dimensionais, as quais usam múltiplas variáveis temporais definidas em domínios de tempo deformados e não deformados, para lidar, de forma eficaz, com as disparidades existentes entre as diversas escalas de tempo. De modo a poder tirar proveito dos diferentes ritmos de evolução temporal existentes entre correntes e tensões com variação muito rápida (variáveis de estado activas) e correntes e tensões com variação lenta (variáveis de estado latentes), são utilizadas algumas técnicas numéricas avançadas para operar dentro dos espaços multi-dimensionais, como, por exemplo, os algoritmos multi-ritmo de Runge-Kutta, ou o método das linhas. São também apresentadas algumas estratégias de partição dos circuitos, as quais permitem dividir um circuito em sub-circuitos de uma forma completamente automática, em função dos ritmos de evolução das suas variáveis de estado. Para problemas acentuadamente não lineares, são propostos vários métodos inovadores de simulação a operar estritamente no domínio do tempo. Para problemas com não linearidades moderadas é proposto um novo método híbrido frequência-tempo, baseado numa combinação entre a integração passo a passo unidimensional e o método seguidor de envolvente com balanço harmónico. O desempenho dos métodos é testado na simulação de alguns exemplos ilustrativos, com resultados bastante promissores. Uma análise comparativa entre os métodos agora propostos e os métodos actualmente existentes para simulação RF, revela ganhos consideráveis em termos de rapidez de computação.

Protein phosphatases acting on the replication checkpoint

A génese de um cancro está dependente da acumulação de mutações genéticas que dão origem a instabilidade genómica, que por sua vez resulta na proliferação descontrolada. Para prevenir a acumulação destas mutações, as células têm mecanismos de controlo (checkpoints) que suspendem o ciclo celular e accionam as vias de reparação do ADN. Estes eventos são muitas vezes regulados por dinâmicas de (des)fosforilação de proteínas. As proteínas fosfatases (PPs), enzimas responsáveis pela remoção do grupo fosfato de resíduos fosforilados, desempenham funções cruciais na regulação de muitos mecanismos celulares. Enquanto que no início do projecto as cinases envolvidas no checkpoint da replicação estavam bem estabelecidas, as PPs envolvidas não eram conhecidas. A Chk1, um componente da maquinaria do checkpoint da replicação, é exemplo dessa regulação por (des)fosforilação, como sejam nos resíduos Ser317 e Ser345. Assim, como primeira abordagem para determinar quais os grupos de PPs envolvidos na regulação do checkpoint da replicação, decidimos investigar o seu papel na regulação da fosforilação da Chk1. A primeira conclusão é que a desfosforilação da Chk1 ao longo do tempo, tanto in vivo como in vitro, ocorre com uma dinâmica bi-fásica. Em segundo, a abordagem in vitro sugere que as famílias PP1, PP2A e PP2C estão envolvidas na desfosforilação da Chk1. Uma vez que a família PP2A foi a que mostrou a maior acção nesta reacção, decidimos investigar outros membros da família in vivo, primeiro com uma abordagem geral (tratando com OA ou sobreexpressando a PME-1), e depois com o knockdown específico da PP4 e PP6 (através de siRNA). Os resultados mostram que a inibição das PPs afectam tanto a desfosforilação como o estado de activação da Chk1 em resposta a tratamento com Hidroxiureia (HU). Todas as PPs testadas in vivo pareceram ser capazes de regular, a níveis diferentes, tanto a fosforilação como a desfosforilação da Chk1. A função das PPs foi também investigada ao nível: da regulação do disparo das origens de replicação, e da recuperação da suspensão da replicação, induzida pela HU. No último caso, os dados indicam que na situação simultânea de knockdown da PP4 com tratamento de HU, há um atraso do ciclo celular na resolução da transição de G2/M. No ensaio de replicação por pulse-chase, os resultamos mostram que tanto o tratamento com OA, como a sobre-expressão de I-2 ou PME-1, atrasam a cronologia do disparo programado das origens de replicação. No entanto, nenhum dos tratamentos efectuados parece desregular o início do checkpoint da replicação. Um rastreio de 2-híbrido de levedura com uma biblioteca de cDNA de testículo humano foi realizado, usando a Chk1 como isco, no sentido de descobrir novos interactores e definir novas possíveis funções para a Chk1 no contexto da meiose. Com base nos resultados do rastreio, duas novas funções são sugeridas: a interacção com a GAGE12 sugere uma função na recombinação genómica/vigilância do genoma durante a meiose, e as interacções com a EEF1α1 e a RPS5 sugerem uma função na regulação da síntese proteíca. Estas experiências fornecem um visão geral para a compreensão da diversidade de funções das proteínas fosfatases envolvidas no checkpoint da replicação, bem como, abre novos caminhos para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento do cancro.

Chalcogenide thin films for solar cells: growth and properties

Thin film solar cells have in recent years gained market quota against traditional silicon photovoltaic panels. These developments were in a large part due to CdTe solar panels on whose development started earlier than their competitors. Panels based on Cu(In,Ga)Se2 (CIGS), despite being more efficient in a laboratory and industrial scale than the CdTe ones, still need a growth technology cheaper and easier to apply in industry. Although usually presented as a good candidate to make cheap panels, CIGS uses rare and expensive materials as In and Ga. The price evolution of these materials might jeopardize CIGS future. This thesis presents three different studies. The first is the study of different processes for the incorporation of Ga in a hybrid CIGS growth system. This system is based on sputtering and thermal evaporation. This technology is, in principle, easier to be applied in the industry and solar cells with efficiencies around to 7% were fully made in Aveiro. In the second part of this thesis, a new material to replace CIGS in thin film solar cells is studied. The growth conditions and fundamental properties of Cu2ZnSnSe4 (CZTSe) were studied in depth. Suitable conditions of temperature and pressure for the growth of this material are reported. Its band gap energy was estimated at 1.05 eV and the Raman scattering peaks were identified. Solar cells made with this material showed efficiencies lower than 0.1%. Finally, preliminary work regarding the incorporation of selenium in Cu2ZnSnS4 (CZTS) thin films was carried out. The structural and morphological properties of thin films of Cu2ZnSn(S,Se)4 have been studied and the results show that the incorporation of selenium is higher in films with precursors rather with already formed Cu2SnS3 or Cu2ZnSnS4 thin films. A solar cell with 0.9 % of efficiency was prepared.

Aprendizagem e representações da língua portuguesa por lusodescendentes

O papel da língua portuguesa (LP) em contexto migratório não tem ocupado as agendas investigativas; os estudos existentes não focam a natureza da LP dentro das próprias Associações nem a forma como elas colidem ou são consistentes com as representações dos membros das comunidades e com as representações dos professores e lusodescendentes que circulam dentro das próprias Associações. Neste estudo, colocamos o enfoque no ensino-aprendizagem da LP em contexto associativo em França (região parisiense) - mais concretamente, na transmissão de uma história e de uma língua ao longo de três gerações de lusodescendentes, tendo como referência um território de origem – real ou imaginário. Visamos, em particular, mais em concreto, mostrar como a LP, em contacto com outra língua, evolui de forma mais ou menos (des)equilibrada, criando um sistema linguístico híbrido que o ensino-aprendizagem, em contexto alargado, procura preencher. As relações entre práticas langagières e processos de identificação dos jovens da região parisiense foram analisadas na dialéctica do Mesmo e do Outro com o principal intuito de problematizar a forma como os lusodescendentes vivem as representações linguísticas de (des)valorização que o Outro concebe e lhes reenvia. Os dois pólos de referência identitária – o país de origem da família e a França – parecem atrair-se e repelir-se. Para além disso, da análise das referidas práticas langagières, sobressai um bricolage identitário e linguístico permanente, que se acomoda a uma vivência por vezes difícil de assumir. Procedemos à identificação dos diferentes factores: o estatuto da LP em contexto associativo e as suas dimensões ideológicas; os objectivos do ensino-aprendizagem; o perfil linguístico do lusodescendente e a construção do conhecimento profissional dos professores que aí leccionam, que informa e fundamenta as suas práticas, o que vem configurar um processo de elevada complexidade. No âmbito desta investigação mista (qualitativa e quantitativa), levada a cabo, desde 2003, é, assim, nossa intenção, evidenciar a produtividade da investigação sobre esta temática, no sentido de problematizar a consciencialização do ensino-aprendizagem da LP. Como conclusões principais salientamos o papel inquestionavelmente relevante das Associações no desenvolvimento das competências de compreensão e comunicação em LP, mas que carecem de reconhecimento e de apoio orçamental. Estas são objecto de diversas polémicas, acusadas de serem a causa do encerramento de turmas de português no sistema educativo oficial francês e catalogadas de exclusão e isolamento. Este ensino-aprendizagem quer valorizar a partilha de um contexto sociocultural que permite aos lusodescendentes a interacção e a comunicação como também uma certa valorização da identidade cultural portuguesa extra muros. As Associações trabalham a motivação dos lusodescendentes para que estes não abandonem nem a língua nem a cultura. Terminamos procurando, de algum modo, dar um contributo, quanto ao ensino da LP, na valorização e promoção do seu ensino nas Comunidades.

Identification of protein complexes in Alzheimer's disease

A Doença de Alzheimer (AD) é a maior doença neurodegenerativa a nível mundial, e a principal causa de demência na população idosa. O processamento da proteína precursora de amilóide (APP) pelas β- e g- secretases origina o peptídeo Aβ, que agrega em oligómeros neurotóxicos e em placas senis. Estes são eventos-chave na patogénese da DA que levam à rutura da neurotransmissão sináptica, morte neuronal e inflamação neuronal do hipocampo e córtex cerebral, causando perda de memória disfunção cognitiva geral. Apesar dos grandes avanços no conhecimento do papel do processamento da APP na DA, a sua função fisiológica ainda não foi totalmente elucidada. Os mapas de interações proteína-proteína (PPI) humanos têm desempenhado um papel importante na investigação biomédica, em particular no estudo de vias de sinalização e de doenças humanas. O método dois-híbrido em levedura (YTH) consiste numa plataforma para a produção rápida de redes de PPI em larga-escala. Neste trabalho foram realizados vários rastreios YTH com o objetivo de identificar proteínas específicas de cérebro humano que interagissem com a APP, ou com o seu domínio intracelular (AICD), tanto o tipo selvagem como com os mutantes Y687F, que mimetizam o estado desfosforilado do resíduo Tyr-687. De facto, a endocitose da APP e a produção de Aβ estão dependentes do estado de fosforilação da Tyr-687. Os rastreios YTH permitiram assim obter de redes proteínas que interagem com a APP, utilizando como “isco” a APP, APPY687F e AICDY687F. Os clones positivos foram isolados e identificados através de sequenciação do cDNA. A maior parte dos clones identificados, 118, correspondia a sequências que codificam para proteínas conhecidas, resultando em 31 proteínas distintas. A análise de proteómica funcional das proteínas identificadas neste estudo e em dois projetos anteriores (AICDY687E, que mimetiza a fosforilação, e AICD tipo selvagem), permitiram avaliar a relevância da fosforilação da Tyr-687. Três clones provenientes do rastreio YTH com a APPY687F foram identificados como um novo transcrito da proteína Fe65, resultante de splicing alternativo, a Fe65E3a (GenBank Accession: EF103274), que codifica para a isoforma p60Fe65. A p60Fe65 está enriquecida no cérebro e os seus níveis aumentam durante a diferenciação neuronal de células PC12, evidenciando o potencial papel que poderá desempenhar na patologia da DA. A RanBP9 é uma proteína nuclear e citoplasmática envolvida em diversas vias de sinalização celulares. Neste trabalho caracterizou-se a nova interação entre a RanBP9 e o AICD, que pode ser regulada pela fosforilação da Tyr-687. Adicionalmente, foi identificada uma nova interação entre a RanBP9 e a acetiltransferase de histonas Tip60. Demonstrou-se ainda que a RanBP9 tem um efeito de regulação inibitório na transcrição mediada por AICD, através da interação com a Tip60, afastando o AICD dos locais de transcrição ativos. O estudo do interactoma da APP/AICD, modelado pela fosforilação da Tyr-687, revela que a APP poderá estar envolvida em novas vias celulares, contribuindo não só para o conhecimento do papel fisiológico da APP, como também auxilia a revelar as vias que levam à agregação de Aβ e neurodegeneração. A potencial relevância deste trabalho relaciona-se com a descoberta de algumas interações proteicas/vias de sinalização que podem que podem ser relevantes para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas na DA.

New oxomolybdenum(VI) hybrid materials

In this thesis, 2,2’-bipyridine (bipy), di-tert-butyl-2,2’-bipyridine (di-t-Bubipy), 2,2’-bipyridine-5,5’-dicarboxylic acid (H2bpdc), 2-[3(5)-pyrazolyl]pyridine (pzpy) and 2-(1-pentyl-3-pyrazolyl)pyridine (pent-pp) ligands were used as the N,N-chelate ligands in the formation of discrete [MoO2Cl2L]-type complexes. These complexes were employed as precursors for the preparation in aqueous media of oxomolybdenum(VI) products with a wide range of structural diversity. Three distinct heating methods were studied: hydrothermal, reflux or microwave-assisted synthesis. An alternative reaction with the inorganic molybdenum(VI) trioxide (MoO3) and the ligands di-t-Bu-bipy, H2bpdc and pzpy was also investigated under hydrothermal conditions. The distinct nature of the N,N-chelate ligands and/or the heating method employed promoted the isolation of a series of new oxomolybdenum(VI) hybrid materials that clearly reflected the strong structure-directing influence of these ligands. Thus, this thesis describes the synthesis and characterization of the discrete mononuclear [MoO2Cl2(pent-pp)], the dinuclear [Mo2O6(di-t-Bu-bipy)2] and the octanuclear [Mo8O22(OH)4(di-t-Bu-bipy)4] complexes as well as the highly unique polymeric materials {[MoO3(bipy)][MoO3(H2O)]}n, (DMA)[MoO3(Hbpdc)]·nH2O, [Mo3O9(pzpy)]n and [Mo2O6(pent-pp)]n (fine structural details of compound [Mo2O6(pent-pp)]n are presently unknown; however, characterization data strongly pointed toward a polymeric oxide hybrid compound). The catalytic behaviour of the discrete complexes and the polymeric compounds was tested in olefin epoxidation reactions. Compounds [Mo3O9(pzpy)]n and [Mo2O6(pent-pp)]n acted as sources of soluble active species that where identified as the oxodiperoxido complexes [MoO(O2)2(pzpy)] and [MoO(O2)2(pent-pp)], respectively. The majority of the compounds here presented were fully characterized by using solid-state techniques, namely elemental analyses, thermogravimetry, FT-IR, solid-state NMR, electron microscopy and powder X-ray diffraction (both from laboratory and/or synchrotron sources).

Ensino superior como princípio hegemónico de cidadania na sociedade civil: um diálogo com António Gramsci no sul da Amazónia brasileira

A tese tem como foco quatro eixos centrais: o ensino superior, a sociedade civil, a cidadania e a hegemonia. Na primeira parte da tese, estes eixos teórico-conceptuais são explanados numa perspectiva da promoção de uma compreensão mais ampla da sociedade civil e do estado, nomeadamente o contratualismo, o liberalismo, o materialismo e o neoliberalismo. Um protagonismo fundamental é atribuído às concepções de Antonio Gramsci de sociedade civil, cidadania e estado aplicadas no ensino superior no Sul da Amazónia brasileira. A segunda parte da tese concentra-se num estudo de caso com três premissas de análise: a fragmentação do ensino superior brasileiro; a reconfiguração da cidadania e hegemonia; e o ensino superior no contexto do Amazonas. O ensino superior no Brasil teve início com as escolas jesuíticas, que, depois de encerradas pelo Marquês de Pombal não tiveram sucessoras em solo brasileiro, ao nível do que poderia ter sido o embrião de um sistema de ensino superior. A chegada da Corte Imperial Portuguesa, em 1808, permite reinstalar novos cursos. A primeira unidade de ensino superior no Amazonas surge apenas no princípio do século XX. Um século depois, tem início o processo de expansão com a implantação de unidades no interior do estado. O ensino superior no Brasil, nas últimas décadas, assumiu um caráter híbrido e de massificação. A massificação, no entanto, ainda é uma realidade a ser alcançada. Apesar dos avanços realizados na última década, ainda subsiste ainda uma forte exclusão de estudantes. O enfoque sobre o ensino superior e a cidadania, no contexto do Amazonas, surge na articulação de um conjunto de informação empírica, extraída de entrevistas realizadas com atores chave locais, com as categorias de pensamento de Antonio Gramsci, que sustentam teoricamente o estudo. Esta articulação tem no ensino superior a possibilidade de desenvolver a cidadania como o princípio organizador e fim último deste nível de ensino. Neste sentido, a hegemonia ganha um estatuto de orientação e direção que permite aos sujeitos envolvidos no ensino superior maior possibilidade de autonomia, liberdade, justiça social, empregabilidade e desenvolvimento social. O modelo de universidade para a cidadania apresenta-se como uma possibilidade de mudanças no horizonte social, económico e também político, no interior da própria universidade. O ensino superior, perspectivado como um instrumento essencial para a cidadania, tem como objetivo primordial a qualificação de professores para a educação de base, Reflexivamente, esta qualificação não deixará potencialmente de produzir retornos positivos na própria expansão e abrangência numérica e educativa do próprio ensino superior. Desta forma, a cidadania no ensino superior é perspectivada neste estudo como um deslocamento de lógicas de compreensão individual e de individualização elitista dos benefícios para lógicas assentes em construções mais coletivas, portadoras de benefícios sociais. A interiorização do ensino superior no Amazonas é assumida no estudo como uma possibilidade de formação académica para o desenvolvimento de práticas pedagógicas e científicas críticas e mais conscientes, constituindo um horizonte determinante para a ativação de processos de integração regional e nacional. Em suma, os pontos de confluência entre o ensino superior, a sociedade civil, a cidadania e as propostas de Gramsci, estão relacionados com a formação, a conscientização política, e o bem-estar económico e social.

Identification of molecules and pathways regulating mistranslation in Candida albicans

Candida albicans is the major fungal pathogen in humans, causing diseases ranging from mild skin infections to severe systemic infections in immunocompromised individuals. The pathogenic nature of this organism is mostly due to its capacity to proliferate in numerous body sites and to its ability to adapt to drastic changes in the environment. Candida albicans exhibit a unique translational system, decoding the leucine-CUG codon ambiguously as leucine (3% of codons) and serine (97%) using a hybrid serine tRNA (tRNACAGSer). This tRNACAGSer is aminoacylated by two aminoacyl tRNA synthetases (aaRSs): leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) and seryl-tRNA synthetase (SerRS). Previous studies showed that exposure of C. albicans to macrophages, oxidative, pH stress and antifungals increases Leu misincorporation levels from 3% to 15%, suggesting that C. albicans has the ability to regulate mistranslation levels in response to host defenses, antifungals and environmental stresses. Therefore, the hypothesis tested in this work is that Leu and Ser misincorporation at CUG codons is dependent upon competition between the LeuRS and SerRS for the tRNACAGSer. To test this hypothesis, levels of the SerRS and LeuRS were indirectly quantified under different physiological conditions, using a fluorescent reporter system that measures the activity of the respective promoters. Results suggest that an increase in Leu misincorporation at CUG codons is associated with an increase in LeuRS expression, with levels of SerRS being maintained. In the second part of the work, the objective was to identify putative regulators of SerRS and LeuRS expression. To accomplish this goal, C. albicans strains from a transcription factor knock-out collection were transformed with the fluorescent reporter system and expression of both aaRSs was quantified. Alterations in the LeuRS/SerRS expression of mutant strains compared to wild type strain allowed the identification of 5 transcription factors as possible regulators of expression of LeuRS and SerRS: ASH1, HAP2, HAP3, RTG3 and STB5. Globally, this work provides the first step to elucidate the molecular mechanism of regulation of mistranslation in C. albicans.